|
INTRODUZIONE
Il trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche rimane il trattamento di scelta per la cura di molti tumori del sangue; le complicazioni maggiori derivanti da questo tipo di
approccio sono rappresentati:
a) dalla "malattia del trapianto verso l'ospite" (GVHD; graft versus host disease), mediata dai linfociti T immunocompetenti del donatore
che riconoscono gli alloantigeni presenti sulle cellule del ricevente;
b) dal grave stato di immunodeficienza che persiste per alcuni mesi dopo il trapianto, rendendo i pazienti suscettibili allo sviluppo di infezioni gravi e spesso mortali.
Se da un lato i linfociti T maturi del donatore rappresentano il fattore scatenante della malattia da trapianto contro l'ospite,
dall'altro essi giocano un ruolo molto importante nel favorire la ricostituzione immunitaria e nel mediare un effetto anti-tumorale a lungo termine (GVL, graft versus leukemia). Pertanto,
la loro eventuale rimozione dal tessuto da trapiantare potrebbe sicuramente prevenire la GVHD, ma comporterebbe un aumentato rischio di fallimento dei trapianto e di recidiva tumorale,
nonché un prolungato stato di immunodeficienza post-trapianto, soprattutto negli adulti.
La possibilità di modificare geneticamente le cellule T del donatore, in modo da far loro esprimere un gene suicida, ha aperto interessanti prospettive per riuscire a modulare in
vivo la malattia da trapianto verso l'ospite, senza rinunciare all'effetto antitumorale dei linfociti alloreattivi del donatore.
Il gene della timidina kinasi del virus herpes simplex di tipo 1 (HSV-l/TK) è in grado di rendere le cellule sensibili al ganciclovir (GCV) e all'aciclovir (ACV), due analoghi
nucleosidici normalmente utilizzati per il trattamento delle infezioni erpetiche; la timidina kinasi di HSV-1 è in grado di fosforilare sia il GCV che l'ACV e di convertirli in una
forma monofosfato che viene successivamente fosforilata da kinasi cellulari e convertita nella forma trifosfato; quest'ultima è responsabile del blocco della sintesi dei DNA
celluiare in replicazione e della conseguente morte cellulare.
I vettori retrovirali rappresentano ancor oggi il sistema di trasferimento genico più utilizzato nei protocolli clinici di terapia genica; questo, in virtù della loro
capacità di integrarsi stabilmente nelle genoma cellulare e di garantire, pertanto, una permanenza stabile del gene trasferito non solo nella cellula inizialmente tradotta ma anche
in tutta la sua progenie.
FINALITA' E SVILUPPO DEL PROGETTO
Questo progetto è finalizzato allo sviluppo di vettori retrovirali di tipo Moloney contenenti due diversi mutanti della timidina kinasi di HSV-1, chiamati, rispettivamente, TK 30
e TK 226; questi mutanti sono stati sviluppati nei laboratori della Dott. M. Black, Università di Washington, mediante mutagenesi casuale della sequenza nucleotidica virale in
corrispondenza del sito di legame dell'enzima con gli analoghi nucleosidici. Questi mutanti sono in grado di conferire alle cellule che li contengono una sensibilità al ganciclovir
(TK30) ed all'aciclovir (TK226) notevolmente superiore (fino a 500 volte, a seconda del tipo cellulare testato) a quella della proteina TK selvaggia.
I vettori contenenti i due diversi mutanti saranno utilizzati per infettare, ex vivo, linfociti T maturi di donatori sani nella prospettiva di un loro successivo impiego in protocolli
clinici di immunoterapia dei tumori per il controllo della GVHD nei pazienti trapiantati con midollo allogenico.
Per poter identificare e selezionare le cellule contenenti i mutanti, verrà clonato in entrambi i vettori il gene marcatore
DLNGFR, che codifica il recettore a bassa affinità per il fattore di crescita neuronale, troncato nel dominio
intracitopiasmatico; si tratta di un marcatore non immunogeno, essendo normalmente espresso alla superficie delle cellule nervose, e fisiologicamente inattivo, essendo esso incapace di
trasdurre il segnale all'interno della cellula; la presenza di questo marcatore consentirà di selezionare rapidamente i linfociti T trasdotti utilizzando procedure di separazione
con biglie magnetiche già ampiamente utilizzate nella pratica clinica. Per rendere possibile l'espressione di entrambi i geni, in ciascun vettore verrà inserita una sequenza
IRES, derivante dal virus dell'encefalomiocardite; questa sequenza è in grado di mediare un processo di traduzione di due diverse proteine a partire da un singolo RNA
messaggero.
Una volta terminata la costruzione dei due vettori, ne verrà saggiata la funzionalità mediante trasfezioni in transient in linee cellulari bersaglio di tipo murino;
verranno successivamente sviluppate delle linee cellulari di packaging in grado di produrre stabilmente entrambi i vettori in forma di virioni ricombinanti difettivi per la replicazione.
Per minimizzare il rischio che si formino virus selvaggi in seguito ad eventi di ricombinazione, verrà utilizzata una linea celluiare di packaging anfotropico di terza generazione,
la GP+envAm12, in cui le funzioni di packaging dei virus Moloney (sequenze virali gag/pol ed env) sono veicolate da plasmidi diversi.
Per ciascun vettore verranno selezionati diversi cloni di packaging, e ne verrà saggiato il titolo virale nel sovranatante di coltura; i cloni che produrranno virus a più
alto titolo verranno utilizzati per i successivi esperimenti di infezione dei linfociti T primari.
La sensibilità al GCV e all'ACV dei linfociti trasdotti verrà testata in vitro utilizzando saggi di proliferazione cellulare e di citotossicità.
Seguirà una fase di ottimizzazione dei protocolli di trasduzione in vitro, in cui verrà saggiata l'influenza di diverse variabili sull'esito del processo infettivo (durata
del tempo di pre-stimolazione in presenza di citochine, infezione singola o ripetuta nel tempo, impiego del frammento ricombinante di fibronettina CH296).
Mediante analisi molecolare della regione ipervariabile della catena B del recettore delle cellule T (TCRBV) verrà studiata l'influenza che i processi di infezione, selezione ed
espansione ex vivo delle cellule trasdotte possono avere sulla diversità del repertorio immunologico T.
I risultati ottenuti da questo studio verranno quindi utilizzati per disegnare un protocollo clinico di trasferimento genico finalizzato a preservare sia la capacità proliferativa
che la variabilità immunologica delle cellule T geneticamente modificate.
RISULTATI
Il lavoro finanziato da questa borsa di studio è stato svolto in collaborazione con l'Istituto di Microbiologia dell'Università di Padova.
Per la costruzione dei vettori contenenti i due diversi mutanti è stata disegnata una strategia a due tappe:
a) costruzione della cassetta IRES/DLNGFR mediante inserimento del gene marcatore ALNGFR nel plasmide pSXLC-TK contenente la sequenza IRES; estrazione della cassetta IRES/DLNGFR e suo successivo clonaggio nel vettore MFG;
b) clonaggio dei mutanti TK30 e TK226 immediatamente a monte della cassetta IRES/DLNGFR.
Per quanto riguarda la prima parte dei lavoro, è stato necessario ricorrere alla mutagenesi mediante PCR della porzione in 5' della
sequenza codificante il DLNGFR, al fine di inserire un opportuno sito di
restrizione in corrispondenza dei codone di inizio ATG dei gene; questo avrebbe consentito di posizionare il gene marcatore immediatamente a valle della sequenza IRES e di sfruttarne
così in maniera ottimale il meccanismo di traduzione. Il prodotto di PCR è stato quindi clonato in un vettore di epressione e sequenziato per verificare che la mutagenesi
operata in PCR non avesse alterato in altri punti la sequenza nucleotidica del gene marcatore. Il DLNGFR è stato quindi inserito nel plasmide pSXLC-TK, immediatamente a valle della sequenza IRES; la cassetta IRES/DLNGFR così ottenuta è stata estratta dal plasmide mediante digestione
enzimatica e purificata per il successivo inserimento nel vettore MFG.
Per quanto riguarda la seconda fase dello sviluppo dei vettori, i piasmidi contenenti i due mutanti TK30 e TK226 sono stati purificati su larga scala e studiati mediante analisi di
restrizione per individuare la corretta strategia di clonaggio. Le sequenze codificanti di entrambi i mutanti sono state quindi isolate mediante digestione enzimatica e purificate da gel
di agarosio per il successivo clonaggio nel vettore MFG, subito a monte della cassetta IRES/DLNGFR.
Dott.ssa Ilaria Giaretta
|