INTRODUZIONE
Il Mieloma Multiplo (MM) è a tutt'oggi considerato una neoplasia incurabile delle cellule B caratterizzata da una espansione clonale delle plasmacellule che producono immunoglobuline (Ig) monotipiche. Gli attuali protocolli clinici, basati su polichemioterapia ad alte dosi con vincristina, doxorubicina, desametasone (VAD), seguita da mobilizzazione delle cellule staminali periferiche (PBSC) mediante cilofosfamide, raccolta delle PBSC CD34+ e reinfusione dopo condizionamento con melphalan, hanno permesso un discreto controllo della sintomatologia e una modesta regressione della massa tumorale allungando la sopravvivenza di questi pazienti. Dai dati di letteratura risulta che, con questo protocollo terapeutico, circa il 40-50% dei pazienti raggiungono la remissione clinica completa, tuttavia il clone neoplastico non viene mai completamente eradicato e la ricaduta resta pressoché inevitabile. Al momento della ripresa di malattia dopo il primo trapianto la procedura di condizionamento e la reinfusione di PBSC viene ripetuta una seconda volta. Il riarrangiamento monoclonale VDJ delle catene pesanti, delle immunoglobuline (IgH) rappresenta un marker clonotipico unico, che assume importanza prognostica in quanto consente di valutare l'efficacia della terapia e di quantificare la malattia minima residua (MMR) nel follow-up post trapianto.
L'applicazione della tecnica di PCR (polymerase chain reaction) ha permesso di sviluppare metodi di indagine estremamente sensibili per l'analisi del riarrangiamento monoclonale delle IgH. La banda monoclonale viene identificata usando una batteria di primers famiglia specifici per il framework-1 (FR-1) o per la regione leader delle IgH in associazione con un primer antisenso JH. Il frammento di interesse viene quindi sequenziato e si procede alla sintesi di due primer paziente specifici a livello dei domini ipervariabili CDRII e CDIII. Questi primer vengono poi impiegati in nested PCR per la.valutazione della MMR.
La sensibilità della tecnica consente di rilevare una cellula mielomatosa su 104-105 cellule normali. Questo metodo è tuttavia molto laborioso e la tecnica di nested PCR comporta notevoli rischi di contaminazione.
Allo scopo di ovviare a questi limiti è stata messa a punto nel nostro laboratorio una metodica di biologia molecolare basata sull'impiego di PCR con primer fluorescenti, seguita dall'analisi degli amplificati mediante elettroforesi capillare con ABI PRISM 310.
MATERIALI E METODI
Selezione dei pazienti e raccolta dei campioni
Sono stati selezionati per questo studio 36 pazienti di età compresa fra 36 e 66 anni, giunti presso la Divisione di Ematologia dell'Ospedale S. Bortolo di Vicenza, nel periodo Gennaio 1999-Luglio 2000 e ritenuti idonei al trapianto autologo con cellule staminali periferiche (PBSC). 27 pazienti erano all'esordio di malattia, 8 avevano gia ricevuto un trapianto presso il nostro Centro ed erano in fase di ricaduta, un paziente è stato arruolato nello studio dopo l'inizio del trattamento chemioterapico.
Per tutti questi pazienti è stato raccolto un campione di sangue midollare al momento della diagnosi o della ricaduta, successivamente un campione di sangue midollare è stato raccolto al termine del ciclo terapeutico VAD, al momento della raccolta delle PBSC, prima del trapianto, all'uscita dall'aplasia post trapianto, quindi a scadenza trimestrale per il primo anno e semestrale successivamente.
Identificazione del riarrangiamento VDJ
Il campione raccolto all'esordio di malattia o al momento della ricaduta è stato amplificato in PCR con due set di primer senso, uno per la regione leader e uno per FR1 rispettivamente insieme a un comune primer antisenso JH marcato con fluorocromo FAM. L'analisi dell'amplificato è stata effettuata utilizzando il programma GeneScan 3.1.2 di ABIPRISM 310. I campioni con riarrangiamento monoclonale sono stati identificati per la presenza di un picco unico o nettamente dominante nel range di 300-350bp per FR-1 e di 450-500bp per la regione leader. I campioni policlonali mostravano invece, nello stesso intervallo, una serie di picchi distanti fra loro 3 bp, distribuiti secondo una curva Gaussiana. La banda monoclonale è stata quindi isolata e sequenziata in modo da individuare le tre regioni ipervariabili, dette complementary determining region (CDRI, CDRII, CDRIII) la cui sequenza è paziente specifica; internamente a CDRII e CDIII sono stati disegnati rispettivamente un primer senso e uno antisenso, che è stato marcato con fluorocromo.
Sensibilità del metodo
La sensibilità del metodo è stata saggiata su 10 pazienti selezionati random, usando direttamente i due primer paziente specifici costruiti. Per ciascun paziente sono state allestite 3 serie di diluizioni progressive del DNA d'esordio, diluito in DNA ottenuto da un pool di donatori; le condizioni di PCR sono state ottimizzate in modo da annullare l'eventuale background dato dal DNA di controllo. Successivamente, tutti i campioni raccolti durante la terapia e il follow-up di questi pazienti sono stati testati usando direttamente i due primer specifici e analizzati mediante GeneScan.
La sensibilità ottenuta, compresa fra 104-105, risulta sovrapponibile ai dati riportati da altri gruppi, che si avvalevano dell'impiego di ASO-Primer in nested PCR.
RISULTATI
Tutti i pazienti inclusi nello studio sono stati avviati alla terapia ad alte dosi, 22 dei nuovi diagnosticati e 7 dei ricaduti hanno completato la terapia e ricevuto il trapianto, 7 hanno interrotto il trattamento per scarsa risposta o l'insorgenza di complicazioni. Il riarrangiamento monoclonale è stato individuato in 26/36 (72%) casi, con una percentuale di plasmacellule compresa fra 1.5-90%. Il sequenziamento diretto del prodotto di PCR è stato possibile in 25 casi con l'impiego del solo primer forward, un caso è stato risolto mediante clonaggio, per tutti i 26 pazienti sono stati sintetizzati due primer tumore-specifici.
Dopo trattamento 8/29 (27.6%) pazienti hanno raggiunto la remissione completa con immunofissazione sierica e urinaria negativa e in due casi si è potuta documentare la transitoria negativizzazione dell'indagine molecolare.
CONCLUSIONI
Da questo studio risulta che l'elettroforesi capillare è metodo pratico e riproducibile, relativamente economico, che consente di discriminare immediatamente fra campioni mono, oligo e policionali.
L'impiego del primer fluorescente permette di lavorare a livelli di sensibilità molto alta, individuando il riarrangiamento monoclonale con quantità dimezzate di DNA (500ng vs 1 mg) rispetto a quanto riportato in letteratura, anche su pazienti trattati, ossia quando la terapia ha già parzialmente ridotto il clone neoplastico.
Il risultato è altamente riproducibile e permette di identificare le esatte dimensioni del picco con una variabilità di 1-2 nucleotidi al massimo. L'impiego inoltre di primer marcati paziente specifici semplifica la procedura e consente di evitare il passaggio di riamplificazione con nested PCR, eliminando il rischio di cross-contaminazioni.
In modo più semplice e abbreviando i tempi di laboratorio è quindi possibile ottenere un risultato sovrapponibile a quello della nested PCR. L'applicazione del metodo potrebbe facilmente essere trasferita per lo studio della MMR ad altre patologie quali leucemie e linfomi.
Il lavoro svolto sarà presentato come poster al 38° Convegno Nazionale della Società Italiana di Ematologia che si terrà a Firenze il prossimo Ottobre.
Dott.ssa Elisabetta Novella