GENE MARKING DI CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE CON VETTORI RETROVIRALI

Introduzione

La possibilità di trasferire geni esogeni nelle cellule staminali emopoietIche ha aperto interessanti prospettive terapeutiche per la cura di numerose malattie umane a carico dei sistema emopoietico; tuttavia, a parte rare eccezioni, i risultati ottenuti in vivo, sino ad oggi, non sono stati molto incoraggianti, a causa della bassa efficienza dei processo di trasferimento genico raggiunto nei precursori staminali e della mancanza di una espressione stabile e duratura dei geni terapeutici nelle cellule bersaglio.

Gli studi di gene marking invece, in cui il gene da trasferire non ha funzione terapeutica ma serve semplicemente da marcatore biologico per poter seguire, in vivo, il destino delle cellule trapiantate, hanno avuto risvolti applicativi di rilevanza immediata nel campo dei trapianti autologhi ed eterologhi di midollo, fornendo informazioni utili sulla biologia dei sistema emopoietico umano e sulla patogenesi di alcune malattie dei sangue.

Agli studi di gene marking appartengono i primi protocolli di trasferimento genico approvati per uso clinico.

Già da alcuni anni, la tecnica della marcatura genetica viene applicata sui precursori staminali di pazienti affetti da AML, neuroblastoma, CML, ALL, linfoma, mieloma multiplo e carcinoma dei seno, destinati a trapianto autologo. Le finalità di questi studi sono diverse: dimostrare l’eventuale contributo dato dalle cellule trapiantate alla ricomparsa del tumore, valutare la loro capacità di restaurare un’ematopoiesi a lungo termine, analizzare l’influenza che i trattamenti ex vivo a carico dei midollo possono avere sulla ripresa a lungo e breve termine dell’ematopoiesi, verificare l’utilità e l’efficacia delle diverse tecniche di purificazione cui vengono generalmente sottoposte le cellule staminali prima di essere reinfuse nei pazienti.

Nei trapianti di midollo eterologhi da donatori non correnti o solo parzialmente correlati, gli studi di marcatura vengono utilizzati per seguire il destino di sottopopolazioni di cellule dei donatore capaci di prevenire le infezioni post-trapianto o lo sviluppo di malattie neopiastiche.

I vettori retrovirali rappresentano attualmente il sistema di trasferimento genico più utilizzato per gli studi di “gene marking” sia in vitro che in vivo; questo, in virtù della loro capacità di integrarsi stabilmente nel genoma cellulare e di garantire, pertanto, una permanenza stabile dei gene trasferito non solo nella cellula inizialmente trasdotta ma anche in tutta la sua progenie. Il limite maggiore all’impiego di tali vettori è rappresentato tuttavia dalla bassa efficienza di trasduzione raggiunta nei precursori staminali a causa della loro incapacità di integrarsi nel genoma di cellule quiescenti.

Per gli studi di “gene marking” è di fondamentale importanza la scelta di un opportuno sistema di marcatura che consenta di selezionare rapidamente ed efficacemente le cellule infettate. Per questo lavoro sono stati scelti come geni marcatori il recettore umano a bassa affinità per il fattore di crescita dei nervi, troncato nel dominio intracitoplasmatico (DLNGFR), ed una variante sintetica della Green Fluorescent Protein (GFP).

Il DLNGFR è un recettore che non viene normalmente espresso sulle cellule dei sistema emopoietico, con la rara eccezione dei linfociti B maturi; tra i vantaggi derivanti dal suo impiego per gli studi di gene marking sono da sottolineare: 1) la totale assenza di immunogenicità, dato che si tratta di una molecola costitutivamente prodotta dall’organismo, 2) la mancanza di attività fisiologica dei recettore, essendo esso troncato nel dominio intracellulare, 3) la facilità e la rapidità con cui possono essere selezionate le cellule trasdotte (FACS e biglie magnetiche). La green fluorescent protein (GFP) è una proteina di 238aa contenente un gruppo cromoforo che le consente di assorbire la luce blu (picco di assorbimento a 395nm) e di emettere fluorescenza nel verde (picco di emissione a 508nm); questo marcatore non richiede alcun substrato cromogeno per essere evidenziato, né procedure di fissazione che potrebbero interferire con la vitalità cellulare. La variante sintetica utilizzata per questo lavoro (EGFP) presenta delle mutazioni nel cromoforo che ne potenziano l’emissione di fluorescenza ed è stata, inoltre, ingegnerizzata al fine di massimizzarne l’espressione nelle cellule umane.

Risultati

Il lavoro finanziato da questa borsa di studio è stato svolto in collaborazione con l’Istituto di Microbiologia dell’Università di Padova dove sono stati inizialmente sviluppati i due vettori retrovirali impiegati per i successivi esperimenti di trasferimento genico nei precursori staminali. Questi vettori, chiamati rispettivamente MFG-DLNGFR ed MFG-EGFP derivano dal virus della leucemia murina di Moloney, e contengono, rispettivamente, i geni DLNGFR e EGFP come marcatori di selezione.

Per poter stabilire un confronto funzionale tra i due diversi sistemi di marcatura in termini di rapidità di selezione, praticità di impiego, accuratezza nella rilevazione dei segnale e tossicita’ cellulare, il DLNGFR e la EGFP sono stati clonati nella stessa posizione dei vettore retrovirale. I due costruiti differiscono, pertanto, solo nella sequenza primaria dei gene marcatore in essi contenuto.

Nel nostro laboratorio sono state sviluppate linee celluiari in grado di produrre entrambi i vettori in forma di virioni ricombinanti difettivi per la replicazione (linee cellulari stabili di packaging anfotropico). Per fare questo è stata utilizzata una linea cellulare di packaging anfotropico di terza generazione, la GP+envAm12, in cui le funzioni di packaging dei virus Moloney (sequenze virali gag/pol ed env) sono veicolate da plasmidi diversi al fine di minimizzare il rischio connesso alla produzione di virioni selvaggi in seguito ad eventi di ricombinazione.

Per ciascun vettore sono stati ottenuti una ventina di cloni cellulari di packaging che differivano tra loro, come accertato da successiva analisi citofluorimetrica, per il livello di espressione dei gene marcatore in essi contenuto.

Per ciascuno di questi cloni è stata valutata la capacità di produrre virioni ricombinanti nel sovranatante di coltura mediante titolazione dello stesso su fibroblasti di topo NIH3T3.

Da questi esperimenti è emersa per entrambi i vettori una correlazione tra il livello di espressione dei gene marcatore nei diversi cloni di packaging e la capacità di questi ultimi di produrre virioni ricombinanti. L’esistenza di questa correlazione è di grande utilità da un punto di vista operativo in quanto consente di semplificare notevolmente le procedure di selezione dei cloni a più alto titolo, restringendo l’analisi a quei cloni in cui il gene marcatore si esprime con maggiore intensità.

La funzionalità dei due vettori è stata inizialmente saggiata in parallelo su tre diverse linee cellulari dei sangue (K562, NB4 e Raji). I risultati migliori sono stati ottenuti infettando le cellule con il vettore MFG-DLNGFR (efficienza di traduzione pari al 70% nella linea eritromieloide k562 contro il 23% ottenuto con il vettore MFG-EGFP) per il quale era stato possibile isolare un clone di packaging che produceva virioni con un titolo (1-3xl07 Unità Infettanti/ml) dieci volte superiore a quello prodotto dai miglior cione di packaging per il vettore MFG-EGFP (1-3x106 Unità Infettanti/ml). Questi risultati concordano con quanto già precedentemente descritto in letteratura, e cioè che l’esito dei processo infettivo dipende strettamente dalla concentrazione di virus presente nel sovratante di coltura usato per infettare le cellule.

Abbiamo quindi monitorato nel tempo l’espressione del DLNGFR e della EGFP (fino a due mesi dall’infezione) nelle K562 trasdotte con entrambi i vettori. I risultati ottenuti dimostrano che i due geni marcatori hanno una cinetica di espressione molto simile: già a 72 ore dall’infezione è possibile valutare con precisione la percentuale di cellule infettate. L’espressione di entrambi i marcatori persiste stabilmente nel tempo senza che siano dimostrabili effetti tossici a lungo termine per le cellule. Successivamente è stata saggiata la capacità dei due vettori di trasdurre cellule staminali purificate da sangue periferico di paziente.

Le cellule venivano prestimolate per 72 ore in un cocktail di citochine costituito da IL1b, IL-3, IL-6, SCF, FL e G-CSF e successivamente sottoposte ad un singolo o ad un doppio ciclo di trasduzione per centrifugazione della durata di 6 ore complessive (4 ore di centrifugazione); l’efficienza di trasduzione veniva valutata a 72 ore dall’infezione mediante analisi citofluorimetrica; le cellule venivano quindi seminate in metilcelluiosa per testarne la capacità clonogenica con i saggi CFC.

I risultati che abbiamo ottenuto in questi esperimenti preliminari, effettuati su campioni congelati di uno stesso paziente, sono stati abbastanza incoraggianti, con una percentuale di trasduzione variabile tra il 9% (vettore MFG-DLNGFR) e il 3% (vettore MFG-EGFP); come per le linee cellulari tale differenza è da attribuirsi alla diversa concentrazione di virioni nei sovranatanti impiegati per il processo di infezione.

Sulla base dei risultati ottenuti da questo studio e qui brevemente accennati, è stato scritto un lavoro per la rivista Haematologica; il lavoro è stato accettato ai primi di Maggio e sarà pubblicato nei mese di luglio.

Tra gli esperimenti che non sono stati descritti nel lavoro perché ancora in fase preliminare, vale la pena di menzionare quello riguardante l’infezione di linfociti primari da donatori sani con il vettore MFG-DLNGFR, in presenza dei frammento di fibronectina ricombinante CH-296. I risultati di questi primi esperimenti sono stati più che mai incoraggianti: con un doppio ciclo di infezione, è stata raggiunta un’efficienza di trasferimento genico pari al 35-40%.

Conclusioni e prospettive future

Questo lavoro ha portato allo sviluppo di due vettori retrovirali che differiscono tra loro solo per la sequenza nucleotidica dei gene marcatore in essi contenuto. La funzionalità di entrambi i costrutti e del relativo sistema di packaging è stata dimostrata sia su linee cellulari che su cellule primarie dei sangue. L’analisi comparativa dei due diversi sistemi di marcatura utilizzati ha dimostrato che sia la EGFP che il DLNGFR consentono una selezione rapida, facile ed accurata delle cellule trasdotte, senza indurre effetti tossici nelle cellule che li esprimono. Il DLNGFR sembra tuttavia preferibile alla EGFP come marcatore da utilizzare per studi clinici, non solo perché si tratta di una molecola priva di immunogenicità, ma anche perché le cellule che lo esprimono possono essere facilmente selezionate con le biglie magnetiche, una procedura, ampiamente utilizzata nella pratica clinica. D’altro canto, la EGFP in virtù della sua fluorescenza intrinseca che consente di evidenziare direttamente le cellule infettate senza dover ricorrere ad una marcatura con anticorpi, potrebbe risultare un marcatore più vantaggioso, in termini di tempo e costi, ai fini della messa a punto e dell’ottimizzazione dei protocolli di trasduzione. In conclusione, l’avere a disposizione due vettori che differiscono unicamente per il gene marcatore in essi contenuto e che si comportano in maniera simile nelle cellule bersaglio presenta un doppio vantaggio: l) i protocolli di trasferimento genico potrebbero essere ottimizzati in vitro utilizzando il vettore MFG-EGFP; 2) le informazioni così ottenute, potrebbero essere applicate successivamente in vivo al vettore MFG-DLNGFR.

I recenti progressi della ricerca nel campo dei vettori retrovirali suggeriscono quali potrebbero essere i possibili futuri sviluppi di questo lavoro:
· ottimizzazione dei protocolli di trasduzione delle cellule staminali mediante l’impiego dei frammento ricombinante di fibronectina CH-296. La fibronectina è una molecola della matrice extracellulare abbondantemente espressa nel microambiente midollare e capace di legare le cellule attraverso tre siti di legame; il frammento ricombinante CH-296 contiene tutti e tre questi siti di adesione e sembra essere in grado di legare anche le particelle retrovirali.
· messa a punto di protocolli di trasferimento genico clinicamente accettabili, mediante l’impiego di terreni “serum free” e ridotta esposizione dei precursori staminali ai fattori di crescita, al fine di preservarne le potenzialità rigenerative.
· utilizzo di modelli animali (topi NOD-SCID) per monitorare in vivo la capacità delle cellule trasdotte e trapiantate di ripopolare a lungo termine il midollo.
· pseudotipizzazione dei due vettori con la proteina pericapsidica dei virus GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus); per pseudotipizzazione s’intende la sostituzione della proteina dei rivestimento esterno di un virus con quella di un altro virus al fine di modificarne lo spettro d’ospite; poiché il recettore per la proteina pericapsidica dei virus GALV è maggiormente espressa sui precursori staminali rispetto al recettore anfotropico dei virus Moloney, pseudotipizzando i due costruiti con suddetta proteina si dovrebbe favorire il legame dei vettori alle cellule bersaglio con conseguente incremento dell’efficienza di trasduzione. A tale proposito, in quest’ultimo mese, siamo riusciti a sviluppare una nuova linea stabile di packaging, derivata dalla linea umana TEFLYGALV in grado di produrre virioni MFG-DLNGFR pseudotipizzati con la proteina dei virus GALV.

Dott.ssa Iaria Giaretta