IL RIARRANGIAMENTO MONOCLONALE DELLE CATENE PESANTI DELLE IMMUNOGLOBULINE COME MARKERS PER IL MONITORAGGIO DELLA MALATTIA MINIMA RESIDUA NEL MIELOMA MULTIPLO

Il mieloma multiplo (MM) è una neoplasia della cellula linfatica B nella sua fase differenziativa terminale di plasmacellula. Il clone neoplastico plasmacellulare è caratterizzato dalla proprietà di produrre immunoglobuline (Ig) monotipiche, che costituiscono la componente monoclonale sierica e/o urinaria.

Il MM rappresenta circa il 10-13% delle neoplasie ematologiche; la malattia si presenta con una frequenza approssimativa di 4 casi ogni 100.000 abitanti/anno e mostra un picco verso la settima decade di vita, mentre risulta particolarmente rara al di sotto dei 40 anni; i dati forniti dal registro dei tumori della Regione Veneto sono sovrapponibili a quelli riportati in letteratura. L’approccio con una terapia sequenziale che prevede una chemioterapia d’attacco più aggressiva, seguita da una terapia mieloablativa e da trapianto di midollo osseo autologo (ABMT) o da cellule staminali periferiche (PBSC) si è rivelato decisamente più promettente rispetto alla terapia definita “convenzionale” con melphalan e prednisolone, che per circa trent’anni aveva rappresentato il “gold standard” terapeutico. Questo approccio sequenziale, adottato anche in pazienti precedentemente trattati con terapia convenzionale, ha portato ad un incremento signifativo della percentuale di remissioni complete (fino al 30-40%), con un prolungamento della sopravvivenza media fino a 5 anni. Inoltre la mortalità trapianto-relata è <3% per cui l’ABMT rappresenta attualmente la terapia di elezione per pazienti al di sotto dei 65 anni, con malattia sintomatica, anche se non ne consente la guarigione e la ricaduta rimane praticamente inevitabile. Alla luce dei dati bibliografici più recenti, si ritiene che la causa principale di recidiva sia dovuta alla persistenza del clone neoplastico, che la chemioterapia non riesce a debellare completamente, piuttosto che alla reinfusione di cellule mielomatose con il trapianto come si riteneva finora. Il trapianto allogenico rappresenterebbe attualmente la migliore strategia terapeutica con possibilità di guarigione per i pazienti con prognosi sfavorevole, tuttavia l’elevata mortalità peritrapiantologica (fino al 40%), la possibilità di reperire donatori HLA compatibili e l’età in genere avanzata di questi pazienti consente l’applicazione di questa procedura ad un numero ridotto di casi.

Poiché la chemioterapia sequenziale non elimina il clone neoplastico, parlare di remissione clinica ha un significato solo parziale. In questi anni molti ricercatori si sono concentrati sulla possibilità di mettere a punto sofisticati metodi che consentano di sorvegliare adeguatamente, soprattutto mediante impiego di sensibili tecniche di biologia molecolare, la Malattia Minima Residua (MMR) andando ben al di sotto della soglia comunemente consentita dai tradizionali metodi (l’analisi morfologica midollare e la valutazione della componente monoclonale sierica) e quindi non solo definire la remissione completa come assenza di MMR, ma soprattutto monitorare e quantificare precocemente la ricomparsa del clone maligno in caso di ricaduta.

Presso la Divisione di Ematologia di Vicenza dal 1995 per i pazienti con età massima di 65-70 anni, confluenti da diverse zone della Regione e che presentano le caratteristiche finora descritte, viene adottato un protocollo basato su una prima fase di polichemioterapia convenzionale con vincristina, doxorubicina, desametasone ad alte dosi (VAD). Segue la mobilizzazione di cellule staminali periferiche (PBSC) mediante ciclofosfamide, la raccolta e selezione delle PBSC CD34+, una terapia di “condizionamento” con melphalan e la reinfusione delle PBSC; in pazienti con ripresa di malattia dopo il primo trapianto la procedura di condizionamento e la reinfusione di PBSC viene ripetuta una seconda volta. Allo scopo di una migliore definizione dell’andamento clinico della malattia risulta utile valutare alcuni parametri laboratoristici correlabili con la prognosi e con l’attività della malattia quali b2-microglobulina, la interleuchina (IL-6) e il labelling index (LI) ossia l’indice di attività proliferativa delle piasmacellule del midollo oltre alla presenza di anomalie citogenetiche, in particolare t(4; 11), t(11, 14) e la delezione parziale o totale dei cromosoma 13; infine alcune molecole di adesione come CD38, CD56, CD138 sembrano avere un ruolo importante nella progressione della malattia per quanto riguarda la massiva infiltrazione del midollo osseo e del sangue periferico da parte delle plasmacellule. Durante l’ontogenesi delle cellule B i geni che codificano per le immunoglobuline (IgH) vanno incontro a un complesso riarrangiamento che porta una delle 40 regioni DH (diversity) a congiungersi con uno dei 6 possibili segmenti JH (joining); successivamente una delle circa 200 regioni VH (variable) si combina al locus DH-JH. La regione riarrangiata VDJ è composta da 4 regioni conservate chiamate framework (FR), interrotte da 3 segmenti altamente variabili chiamati CDR (complementary determining regions) codificanti per il binding-site dell’antigene unico per ciascun linfocita. Nel nostro laboratorio abbiamo applicato questa metodica utilizzando un protocollo di nested PCR che prevede l’impiego di 2 set di primers famiglia specifici per FR1 e uno per la regione leader più a monte e come antisenso un unico primer consenso marcato con fluorocromo, derivato dal segmento JH3’. La banda monoclonale individuata su gel oppure utilizzando il Programma GeneScan 3.1 del sequenziatore automatico ABI PRISM 310 (PE Biosystem) viene poi sequenziata utilizzando il Programma Sequencing Analysis dello stesso strumento e vengono sintetizzati, utilizzando le regioni ipervariabili individuali CDRII e CDRIII, due primers paziente specifici con i quali valutare la componente di cellule mielomatose residue.

I pazienti sono stati seguiti in corso di terapia effettuando una serie di prelievi a scadenze precise: 1’) prelievo di sangue midollare e periferico alla diagnosi, 2’) prima della mobilizzazione con Endoxan, 3’) raccolta di cellule staminali da buffy coat, 4’) prelievo di sangue midollare e periferico prima dei trapianto, 5’) prelievo di sangue periferico all’uscita dall’aplasia, 6’) prelievo di sangue midollare e periferico a distanza di 1, 3, 6, 9 mesi dal trapianto. A seconda della disponibilità di materiale, oltre al DNA, estratto secondo la metodica tradizionale con fenolo-cloroformio, è stata effettuata anche l’estrazione dell’RNA (seguendo le indicazioni riportate da Total RNA Extraction Kit Roche), che può essere utile nel caso fallisca l’analisi sul DNA.. Al fine di valutare la percentuale di plasmacellule malate presenti, su tutti i campioni è stata eseguita l’analisi citofluorimetrica con le seguenti combinazioni di anticorpi monoclonali CD138/38/45, CD138/56/19 3756. Sul solo campione d’esordio inoltre è stata eseguita l’analisi citogenetica classica con bandeggio GTG, dopo stimolazione delle cellule con GM-CSF e IL6 per 4-5gg.

Risultati

Dal gennaio 1999 a oggi nel nostro laboratorio abbiamo selezionato per questo studio 38 pazienti di età compresa fra 36 e 65, una età media 54 anni, dei quali 29 nuovi esordi e 9 in ricaduta, con una percentuale di piasmacellule compresa fra 2-80%. L’analisi molecolare per FRI effettuata solo sul DNA midollare di tutti i campioni raccolti all’esordio ha permesso di individuare una banda monoclonale in 24 casi per 17 dei quali è stato completato il sequenziamento e la sintesi dei primers specifici, avendo ottenuto una banda intensa e nitida, i restanti 7 casi saranno risolti servendosi dei clonaggio. Fatta eccezione per il prelievo di esordio, tutti i campioni successivi sono stati valutati solo con il primer famiglia specifico che ha dato clonalità all’esordio e quindi riamplificati con i primers CDRII e CDRIII dei paziente (nested PCR). Attualmente solo 8 di questi 17 pazienti hanno completato il ciclo terapeutico e l’unico che ha raggiunto la remissione clinica (test di immunofissazione negativa) rimane positivo all’analisi molecolare. Per questo paziente quindi la sorveglianza molecolare risulta particolarmente importante. Per quanto riguarda l’analisi citogenetica classica solo 3 campioni presentano anomalie cariotipiche. Attualmente si attende il risultato dell’Ibridazione in Situ Fluorescente (FISH) che è stata effettuata con l’impiego della sonda genica per l’RB1 sul cromosoma 13 su tutti i campioni a cariotipo apparentemente normale. La delezione di questo gene sembra legata ad un decorso più aggressivo e sfavorevole della malattia.

Conclusioni e obiettivi futuri

I risultati finora ottenuti sono sostanzialmente sovrapponibili ai dati di letteratura anche se attualmente solo pochi pazienti hanno concluso il protocollo terapeutico, ma continuano a risultare positivi all’indagine molecolare. L’impiego di due primers paziente specifici (in CDRII e CDRIII) limita il rischio di falsi positivi, mentre il metodo di nested PCR con diluizioni limite consente di raggiungere una sensibilità di una cellula su 104,104.

Poichè il rischio di ricaduta permane alto in questi pazienti ed è ormai confermata la permanenza in circolo di cellule malate anche dopo terapia ad alte dosi, l’obiettivo futuro è quello di mettere a punto una metodica di PCR quantitativa, servendoci della real time PCR, tecnologia molto più sensibile nel valutare la MMR.

Si sta inoltre valutando la possibilità di applicare un nuovo protocollo terapeutico con doppio trapianto; in tal caso la valutazione quantitativa della malattia in corso di terapia, sarebbe utile anche a confermare la validità del protocollo clinico.

Dott.ssa Elisabetta Novella