ANALISI DEL RIARRANGIAMENTO DELLE CATENE PESANTI DELLE IMMUNOGLOBULINE PER LA VALUTAZIONE DELLA MALATTIA MINIMA RESIDUA NEL MIELOMA MULTIPLO

Aspetti clinici dei Mieloma Multiplo.

Il mieloma multiplo (NM) è una neoplasia dei linfociti B, che interessa la cellula nella sua differenziazione terminale in piasmacellula. Il clone neoplastico solitamente è caratterizzato dalla proprietà di produrre immunoglobuline uguali tra loro, le quali determinano la presenza della componente monoclonale a livello del sangue periferico ed eventualmente a livello delle urine. L’incidenza è circa l’1% di tutte le neoplasle e circa il 10% di quelle ematologiche; la malattia si presenta con una frequenza approssimativa di 4 casi ogni 100.000 abitanti e mostra un picco verso la settima decade di vita, mentre risulta particolarmente rara al di sotto dei 40 anni.

L’eziologia della neopiasia rimane sconosciuta, tuttavia le radiazioni ionizzanti e alcuni agenti chimici sono stati proposti tra i fattori implicati nel favorire la trasformazione neopiastica mielomatosa.

Dal punto di vista clinico, una triade di sintomi indicativa per la diagnosi di mieloma è costituita da dolore osseo, aggravato dal movimento, anemia e insufficienza renale; frequente è la presenza di astenia e facile affaticabilità, legate per lo più alla presenza di anemia, dimostrabile in circa i 2/3 dei casi, mentre il ricorrere di episodi febbrili è correlabile di solito ad infezioni batteriche, a cui i pazienti con mieloma sono particolarmente suscettibili.

La terapia tradizionale del mieloma si è basata per anni sull’uso di agenti alchilanti (in particolare il melphalan) associati a steroidi; l’aggiunta di varie combinazioni di agenti citotossici non ha consentito di raggiungere valori di remissione completa maggiori del 5%, con sopravvivenza media di 36 mesi. Decisamente più promettente si è rivelato, anche per pazienti precedentemente trattati, il trapianto di midollo autologo con cellule staminali periferiche, dopo chemioterapia ad alte dosi, allo scopo di ridurre la componente mielomatosa e di raccogliere sufficienti cellule staminali per il trapianto. Con questo protocollo terapeutico la remissione completa (CR) si ottiene nel 30-40% dei casi, mentre la sopravvivenza media è salita a 5 anni; attualmente pertanto, il trapianto autologo di midollo rappresenta la terapia di scelta in pazienti con età inferiore a 65 anni e con fattori prognostici sfavorevoli, anche se non rappresenta comunque una via di guarigione della malattia e il rischio di ricaduta rimane un evento pressoché inevitabile. La causa principale di recidiva sembra essere dovuta al fatto che nelle cellule reinfuse al momento dei trapianto sono ancora presenti precursori mielomatosi con potenzialità clonogeniche.

L’analisi della malattia minima residua (MRD) mediante impiego di sofisticate tecniche di biologia molecolare ha assunto in questo contesto crescente importanza, sia per la possibilità di quantificare la componente di cellule tumorali residue contaminanti al momento dei trapianto, sia per monitorare il follow-up di questi pazienti.

Il riarrangiamento VDJ.

La presenza di un riarrangiamento monocionale dei geni IgH rappresenta nel mieloma, come in altre patologie di tipo B, un marker di malattia particolarmente importante. Durante l’ontogenesi delle cellule B i geni che codificano per le Immunoglobuline (IgH) vanno incontro a un complesso riarrangiamento che porta una delle 40 regioni DH (diversity) a congiungersi con uno dei 6 possibili segmenti JH (joning); successivamente una delle circa 200 regioni VH (variable) si combina al locus DH-JH. La regione riarrangiata VDJ è composta da 4 regioni conservate chiamate framework (FR), interrotte da 3 segmenti altamente variabili chiamati CDR (complementary determining regions) codificanti per il binding-site dell’antigene unico per ciascun linfocita.

In numerose patologle di tipo B le sequenze CDR vengono utilizzate per disegnare primers paziente specifici per la determinazione della malattia minima residua.

Monitoraggio della Malattia Minima Residua: risultati.

Nel nostro laboratorio abbiamo applicato questa metodica utilizzando un protocollo di nested PCR come segue. Ogni campione è stato analizzato utilizzando, prima una reazione di amplificazione diretta seguita da una reazione di eminested PCR con le coppie di primers degenerati FR3A-LJH, FR2-LJH (reazione diretta) e FR3A-VLJH, FR2-VLJH (reazione eminested), si è passati quindi ad analizzarli utilizzando due set di primers consenso derivati dalla regione leader (VH1LB,... VH6LB) e dall’FR1 (VHD1..VHD4a, VHD4b...VHD6) delle immunoglobuline e come antisenso un primer derivato dal segmento JH3’. L’obiettivo è di sequenziare, mediante un sequenziatore automatico ABI Prism 310, tutti i campioni che mostrano clonalità per una specifica famiglia, per sintetizzare primers paziente specifici, utilizzando le regioni CDRII e CDRIII, con i quali valutare la componente di cellule mielomatose residue, che potrebbero essere reinfuse al momento del trapianto, e monitorare nei mesi successivi il paziente trapiantato.

Il protocollo, compresa la parte di sequenziamento, è stato messo a punto prima su 6 campioni di pazienti affetti da LLC, dove la componente monoclonale è più facilmente individuabile, che sono poi stati utilizzati come controlli avendo dato risultato positivo rispettivamente: 3 per VHD1 e VH1LB, 1 per VHD3 e VH3LB, 1 per VHD5 e VH5LB, 1 soltanto per la famiglia VHD4a.

La stessa metodica applicata a campioni di DNA pre- e post-trapianto relativi a 5 pazienti affetti da Mieloma Multiplo, già sottoposti a terapia pretrapianto con VAD, non ha consentito di rilevare in alcun modo la presenza di una popolazione monoclonale residua di cellule malate, probabilmente per l’elevata competizione della popolazione policlonale coesistente con quella monoclonale fortemente ridotta dalla chemioterapia. Il DNA estratto dalle blopsie ossee eseguite alla diagnosi ha dato invece risultato positivo solo per FR2.

Al momento attuale abbiamo raccolto altri 6 campioni di mieloma: 4 nuove diagnosi, 2 ricadute. Il progetto è di seguire i pazienti effettuando una serie di prelievi a scadenze precise: 1°) prelievo di midollo alla diagnosi, 2°) prima della mobilizzazione con Endoxan, 3°) raccolta di cellule staminali da buffy coat, 4°) prelievo di sangue periferico all’uscita dall’aplasia, 5°) prelievo di midollo ad 1 mese dal trapianto.

A seconda della disponibilità di materiale, oltre al DNA è stata effettuata anche l’estrazione dell’RNA, che può essere utile nel caso fallisca l’analisi sul DNA.

Fatta eccezione per il prelievo di esordio, tutti i campioni successivi verranno valutati solo con il primer famiglia specifico che ha dato clonalità e quindi riamplificati con i primers CDRII e CDRIII dei paziente (nested PCR).

I campioni sono già stati analizzati per FR3A-LJH ed FR2-LYH utilizzando il DNA dei primo prelievo, con i seguenti risultati: 2 casi dei 4 nuovi diagnosticati sono risultati positivi per FR2 ed FR3A, 1 solo per FR2, 1 è risultato negativo; l’unico in ricaduta risulta monocionale per FR2, ma non ha dato alcuna positività per le famiglie in FRI analizzate finora (VHD1, VHD3).

L’analisi per FRI ha dato indubbiamente risultato positivo solo per due pazienti: uno è risultato monoclonale sia con VHD3 sia con VH3LB, l’altro per VHD5. Un altro campione è probabilmente bicionale per VHD5. In tutti i casi si è ottenuta la sequenza completa fino a coprire il CDRIII e in due casi sono già stati sintetizzati i primers paziente specifici.

Conclusioni.

I risultati finora ottenuti concordano sostanzialmente con i dati disponibili in letteratura, anche se indubbiamente è necessario valutare una casistica molto più ampia. Un approccio di questo risulta sicuramente più sensibile rispetto alla sola amplificazione con FR2 ed FR3. Quest’ultima infatti può non riuscire in una significativa percentuale dei casi a causa di mutazioni somatiche che impediscono l’annealing dei primer. Una conferma viene anche dall’unico caso risultato negativo da noi studiato, che invece è risultato monoclonale con l’FRI per la famiglia VHD3. L’impiego di due primers paziente specifici (in CDRII e CDRIII) limita il rischio di falsi positivi, mentre il metodo di nested PCR consente di evitare complesse procedure di clonaggio.

Dott.ssa Elisabetta Novella

La Dott.ssa Novella è beneficiaria della borsa di studio AIL assegnata in memoria di Barbara Carlesso