Il lavoro da me svolto presso il laboratorio di Ematologia, sovvenzionato dall’AIL di Treviso, costituisce il proseguimento del programma di ricerca iniziato nel 1997. Si tratta della messa a punto di tecniche biologico-molecolari che forniscano elevata sensibilità, specificità e rapidità nello studio del chimerismo post-trapianto allogenico. Questo trattamento è attuato in una varietà di neopiasie ematologiche una volta che le cellule maligne sono state eradicate dai paziente attraverso chemioterapia o radioterapia. Lo scopo è quello di rigenerare la funzionalità ematologica e immunitaria nel più breve tempo possibile riducendo i rischi per il paziente. In taluni casi, però, il condizionamento con chemioterapici non garantisce la scomparsa delle cellule neopiastiche. Queste ultime, infatti, possono ricominciare a colonizzare il midollo determinando successivamente una ricaduta. In questa fase, nel paziente, sono presenti sia cellule ematiche dei donatore che del ricevente (chimerismo misto). Risulta quindi determinante individuare all’esordio tali eventi per programmare una nuova terapia. A tale scopo sono stati messi a punto metodi di biologia molecolare che, grazie alla loro maggiore sensibilità e praticità, da tempo hanno sostituito tipizzazione HLA o analisi dei cariotipo.

Per migliorare ulteriormente le nostre capacità di analisi ed anticipare, quindi, i tempi di risposta, si è valutata la possibilità di uso e la sensibilità nel rilevare il chimerismo misto dopo trapianto allogenico di midollo o di PBSC di un prodotto commerciale (AmpF/STR Profiler Plus - PE Applied Biosystems), utilizzando come sistema di rilevazione l’ABI Prism 310. L’AmpF/STR Profiler Plus, generalmente utilizzato nei test di paternità, permette l’amplificazione multipla di 9 differenti STR (ripetizioni di corte sequenze di basi - 2-5bP - in tandem) e dei locus amelogenina; la reazione avviene in un unico tubo. L’Abi Prism 310 è un analizzatore di DNA utilizzato sia per il sequenziamento che per lo studio di frammenti di DNA amplificati; esso rileva il segnale fluorescente e calcola la lunghezza dei frammento e l’area del picco.

La sensibilità e la linearità dei metodo di rilevazione è stata saggiata su una serie di diluizioni sia di campioni di sangue intero sia di campioni di DNA estratto, mescolati in proporzioni variabili. Il range di concentrazione dei vari alleli nelle 15 miscele effettuate per ogni coppia di campioni variava dallo 0.25% al 99.75%. La linearità di risposta nel range 10-90% ha mostrato un r di 0.999.

I livelli di sensibilità medi (quantità minima di un allele rilevabile all’interno di un locus) sono stati pari a 1.5% (range 0.5-2.5). La sensibilità ottenuta è superiore di 2-3 volte rispetto a quella ottenuta con sistemi analoghi da altri gruppi (Thiede et al. 1998, Scharf et al. 1995).

Abbiamo valutato in un campione di 25 coppie di pazienti correlati tra di loro il numero medio dei loci utili per valutare la eventuale ricaduta: il numero di loci utilizzabile era di 5.9 (range 3-11).

Sono stati monitorati 21 casi di trapianto allogenico (18 da donatori familiari, 3 da registro MUD) prima dei trapianto ed almeno a 1, 3 e 6 mesi dal trapianto (range mesi dal trapianto 1-24). I campioni post trapianto sono costituiti da campioni di midollo osseo. In 6 pazienti è stato trovato un chimerismo misto con persistenza degli alleli del ricevente che variava tra 1 e il 3%; questa percentuale rimane costante nel tempo e finora non è stata correlata con fenomeni di ricaduta.

La ripetibilità della dimensione dei frammenti analizzati (cv dei 0.21 %, range 0.12 - 0.5) veniva confermata sia dall’analisi dei 15 alleli dei controllo di qualità interno, sia dalla ripetibilità degli alleli dell’amelogenina nei singoli pazienti.

A sinistra dei frammenti veniva costantemente rilevata una piccola banda più corta di una repeat con un’area di circa l’8% rispetto al picco principale. Questo portava come conseguenza l’impossibilità di utilizzare alleli dei ricevente con una repeat in meno rispetto all’allele dei donatore. La ragione della presenza di questa banda anomala si potrebbe imputare ad un salto di repeat durante la reazione di amplificazione, favorito dalla sequenza ripetuta presente in questo frammento.

In conclusione il sistema descritto si è dimostrato molto utile sia per la sua rapididà (è possibile fornire una risposta dopo 24-48h dal prelievo), che per la sua sensibilità e specificità nel valutare il chimerismo misto dopo trapianto allogenico.

Voglio, ancora una volta, ringraziare l’AIL di Treviso per avermi permesso di proseguire le ricerche in campo ematologico consentendomi nel contempo di migliorami professionalmente. Colgo l'occasione per porgere a tutta l’associazione i più distinti saluti.

Edoardo Missiaglia

Il Dott. Missiaglia è beneficiario della borsa di studio AIL assegnata in memoria di Egidio Da Re