Premessa:

La risposta dei sistema immunitario nel controllo della crescita neoplastica in pazienti con mieloma multiplo rappresenta un aspetto di cruciale importanza. La recente applicazione di terapie mieloablative, come il trapianto di midollo osseo, pone la problematica della risposta immune nel periodo successivo all’applicazione di questi protocolli terapeutici in tali pazienti.

Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare, da un punto di vista fenotipico, la risposta immunitaria dei linfociti T e delle cellule natural killer in pazienti affetti da mieloma multiplo sottoposti ad autotrapianto di midollo. Per questo scopo è stato eseguito lo studio del fenotipo di membrana dei linfociti T e delle cellule NK ottenute dal sangue periferico di pazienti, sia prima del trapianto che ad intervalli di 1, 2, 3 e 6 mesi da quest’ultimo.

Pazienti:

Sono stati studiati 14 pazienti con mieloma multiplo di età compresa tra 42 e 63 anni (età media di 54 anni). La diagnosi è stata realizzata sulla base di esami ematochimici, esami strumentali tra cui infiltrato plasmacellulare midollare >30% e/o presenza di lisi ossee. L’istotipo del mieloma era IgG in 9 pazienti, IgA in 2, micromolecolare in 1 e non secernente in 2. Nove pazienti appartenevano allo stadio II di Durie e Salmon e 5 allo stadio 4. Tutti i pazienti sono stati trattati con chemioterapia citoriduttiva secondo il protocollo VAD per 3 cicli, successiva mobilizzazione delle cellule staminali con elevate dosi di ciclofosfamide (7g/mq). Per il trapianto, i pazienti sono stati condizionati con alte dosi di melphalan (200mg/mq) e successiva infusione di progenitori emopoietici CD34+ variabile da 5 a 6 x 106/kg. 1 pazienti sono stati valutati nel periodo precedente il trapianto di midollo e nel periodo successivo al trapianto (a 1, 2, 3, 6 mesi).

In questi pazienti, il numero dei globuli bianchi e la percentuale dei linfociti nel sangue periferico era nei limiti di norma sia prima del trapianto che a 1, 2, 3 e 6 mesi dallo stesso.

Materiali e Metodi:

Campioni di sangue fresco periferico eparinato sono stati ottenuti dai pazienti nei tempi prefissati.

A questo punto, i campioni di sangue, dopo appropriata diluizione con soluzione fisiologica, sono stati stratificati su gradiente di Ficoll/Paque (Biotech, Uppsala, Sweden) e successivamente centrifugati per 30 minuti a 1500 r.p.m. Dopo tale centrifugazione, l’anello delle cellule mononucleate all'interfaccia tra il Ficoll ed il plasma è stato recuperato con una pipetta Pasteur. Le cellule sono state successivamente lavate per due volte con soluzione fisiologica per 10 minuti a 1500 r.p.m. Le cellule così ottenute sono state risospese in medium (RPMI 1640 della Gibco, Paisley, Scotland) e contate con contaglubuli automatico Coulter.

Analisi citofluorimetrica:

Per l’analisi citofluorimetrica sono stati utilizzati anticorpi monoclonali (AcMo) in grado di legarsi alle seguenti cellule o molecole: CD3 (cellule T totali), CD4 e CD8 (subsets di linfociti T), CD19 (linfociti B), CD25, CD122 e CD132 (catene del recettore per l’IL-2), CD16, CD56, CD57, CD158a e CD158b (cellule NK), HLA-DR e CD69 (molecole di attivazione), CD38 e CD138 (plasmacellule). Tali anticorpi sono stati forniti dalle seguenti ditte: Becton Dickinson, Ortho (CLB, Amsterdam, Holland), Coulter (Florida, USA), Immunotech (Marseille, France), Dako (Denmark), Serotec (Oxford, England), Pharmigen (San Diego, California), ed erano puri o coniugati direttamente con fluorocromi quali l’isotiocianato di fluoresceina (FITC) e la ficoeritrina (PE).

Per quanto riguarda l’immunofluorescenza diretta, 0,5 x 106 cellule in 100 ml di terreno di coltura sono state aliquotate in provette di plastica da 5 ml a fondo rotondo. Successivamente, sono stati aggiunti 10 ml di anticorpi monoclonali, direttamente coniugati con FITC o PE, alle cellule mononucleate, secondo un preciso pannello di marcatura; le cellule sono state quindi incubate a 4°C per 20 minuti e, successivamente, sono state lavate 2 volte consecutive con soluzione fisiologica per 10 minuti a 1500 r.p.m. Le cellule così ottenute sono state risospese in fisiologica e lette al citofluorimetro FACScan (Becton Dickinson). Sono stati acquisiti e analizzati, per ciascun campione, 10.000 elementi con il tipico scatter dei linfociti, utilizzando il programma Cell Quest (Becton Dickinson).

Per quanto riguarda limmunofluorescenza indiretta, alla sospensione cellulare è stato aggiunto un AcMo, non coniugato con fluorocromo. Dopo 20 minuti d’incubazione e lavaggio con fisiologica è stato aggiunto un secondo anticorpo, diretto contro il primo e coniugato con fluoresceina.

Dopo 20 minuti le cellule sono state nuovamente lavate con fisiologica e lette al citofluorimetro. Questa procedura è stata eseguita per gli AcMo anti CD158a e CD158b.

Risultati:

Linfociti T:

L’analisi condotta ha dimostrato che la percentuale di cellule T totali CD3+ (valori normali 75 + 5%) variava di poco nelle determinazioni eseguite nel periodo post-trapianto rispetto all’analisi fatta prima del trapianto di midollo (con valori compresi tra 63% e 75%), senza che vi fossero delle differenze significative. Quando si sono analizzate le sottopopolazioni linfocitarie T, si è osservato che le cellule con fenotipo helper correlato (CD4+) erano diminuite nel periodo che precede il trapianto di midollo (27 + 3%) rispetto ai controlli (valori normali 47 + 7%) e tale riduzione è molto più marcata nel periodo successivo al trapianto stesso.

Per quanto riguarda le cellule con fenotipo citotossico correlato (CD8+), è stato visto che esse erano significativamente aumentate nel periodo che precede il trapianto (48 + 3%) con una differenza marcata rispetto ai soggetti normali (28% + 6). Nel periodo post-trapianto si assisteva a un ulteriore lieve incremento delle cellule CD8+ che persisteva nel tempo, con una punta massima del 63% a 3 mesi dal trapianto. Questi dati indicano uno squilibrio dei subsets T nel paziente con mieloma, sia prima che dopo il trapianto di midollo.

Analisi dei subsets di cellule citotossiche:

Le cellule NK sono state valutate in considerazione dell’incremento delle cellule CD8+, utilizzando marcatori NK-associati quali CD16 (v.n. 13 + 5%), CD57 (v.n. 17 + 4%), CD56 (v.n. 13 + 5%). I subsets delle cellule NK sono stati analizzati utilizzando gli antigeni CD158a (v.n. 6 + 3%) e CD158b (v.n. 4 + 3%). I linfociti CD16+ sono normali percentualmente (18 + 2%) nel sangue periferico di pazienti con mieloma nel periodo che precede il trapianto. Nel periodo post-trapianto era dimostrabile un lieve aumento (punta massima pari a 22%), senza però una differenza statisticamente significativa. Analogo andamento presentavano le cellule che esprimono il marcatore CD56. Le cellule CD57+ erano invece costantemente aumentate nel periodo che precede il trapianto (41 + 3%). Nel periodo successivo al trapianto queste cellule mostravano un ulteriore incremento con punte del 55% a 3 mesi dal trapianto. L’analisi in doppia marcatura mostrava come la maggior parte delle cellule CD57 positive appartenevano al subset linfocitario CD8.

La recente dimostrazione di un repertorio delle cellule NK, legato alla presenza di molecole coinvolte nel riconoscimento di antigeni del sistema maggiore di istocompatibilità ci ha indotto a valutare l’espressione della famiglia delle molecole p58. Con l’uso di anticorpi monoclonali anti-p58 (CD158), e in particolare CD158a (EB6) e CD158b (GL183), è possibile distinguere quattro subsets di cellule NK: EB6+GL183+, EB6+GL183-, EB6-GL183+, EB6-GL183-. Tutti questi subsets sono usualmente presenti nel sangue periferico di soggetti normali. La valutazione citofluorimetrica di questi antigeni eseguita in pazienti con mieloma ha dimostrato che sia linfociti GL183+ che EB6+ sono entrambi regolarmente presenti nel paziente con mieloma multiplo nel periodo pre-trapianto (GL183 = 12 + 2%; EB6 = 9 + 3%) e mostrano un trend all’aumento progressivo nel post-trapianto. Questo andamento sembra maggiormente evidente per il subset GL183 piuttosto che per quello EB6+.

Analisi di molecole di attivazione:

Allo scopo di valutare lo stato di attivazione dei linfociti T ed NK in questi pazienti nelle varie fasi del protocollo sono state prese in considerazione alcune molecole, tra cui l’HLA-DR (v.n. 13% + 5) e il CD69 (v.n. 1 + 0,5%) che compaiono precocemente nell’attivazione linfocitaria in vitro, e componenti del sistema recettoriale che lega l’IL-2, tra cui CD25 (v.n. < 2%), CD122 (v.n. 14 + 3%), CD132 (v.n. 88 + 11) che riconoscono rispettivamente le catene p55, p75 e p64 del sistema recettoriale per l’IL-2.

I dati ottenuti dimostravano che le cellule HLA-DR+ aumentavano (rispetto al soggetto normale) in condizioni pre-trapianto (28 + 4,5%), così come CD69 (7 + 2%), a dimostrazione di un certo stato di attivazione in vivo pre-trapianto. Inoltre, si notava un lieve aumento delle cellule HLA-DR+ nel post-trapianto rispetto al pre-trapianto, mentre per gli altri marcatori non vi erano modificazioni sostanziali nelle varie fasi del protocollo.

Analisi di molecole correlate ai linfociti B:

Lo studio dei linfociti B totali determinato con anticorpi monoclonali che identificano la molecola CD19 (v.n. 10 + 3%) evidenziava una marcatissima riduzione dei linfociti B totali nel periodo che precede il trapianto (4% + 0,5%) di midollo e nei primi mesi dopo il trapianto (1,2 + 0,3% a un mese dal trapianto). Le cellule B rientravano nei range di normalità solo a distanza di qualche mese dopo il trapianto. L’analisi della componente plasmacellulare, e pertanto neoplastica, nel sangue periferico, veniva determinata con l’ausilio di AcMo anti-CD138, molecola che usualmente viene espressa dalle cellule mielomatose o dai suoi precursori. I dati documentano la presenza di sporadiche cellule neoplastiche nel sangue periferico di questi soggetti.

Ringraziamenti:

Desidero esprimere la personale riconoscenza alla Sig.ra Pelos, all’AIL di Treviso ed al Prof. F. Rodeghiero per l’opportunità di studio e lavoro concessami, nonché al Dr. L. Trentin, al Dr. R. Zambello ed alla laureanda Paola Salgarelli per la collaborazione ed i suggerimenti fornitimi durante lo svolgimento di tale lavoro.

Dott. Eliseo Battistin