Il programma prefissato per questo periodo di ricerca era stato focalizzato sullo studio dei chimerismo dopo trapianto allogenico e l’approfondimento di alcune tecniche di biologia molecolare che avessero una ricaduta nello studio delle malattie oncoematologiche. Prima di presentare nel dettaglio il lavoro da me svolto, è necessario fornire un quadro generale degli argomenti da me affrontati.

Studio del chimerismo dopo trapianto allogenico

Il trapianto allogenico di midollo osseo o di cellule staminali è diventato ormai procedura standard per il trattamento di una varietà di neoplasie ematologiche. L’obbiettivo è quello di eradicare le cellule clonali maligne attraverso alte dosi di chemioterapici o irradiazioni total body, seguite dall’infusione di cellule midollari di un donatore sano per ricostituire la funzionalità ematologica e immunitaria nel più breve tempo possibile. Nonostante il condizionamento con chemioterapici ad alte dosi, in alcuni casi si osserva la persistenza di cellule emopoietiche dei ricevente anche dopo il trapianto (chimerismo misto). Questa situazione viene considerata come un segno prognostico negativo, perché può essere seguita dalla riespansione dei clone malato e, successivamente, dalla ricaduta della malattia. Il monitoraggio dei chimerismo nel ricevente, dopo trapianto, risulta quindi fondamentale per valutare precocemente i primi segni di ricaduta.

Nel passato l’utilizzo della tipizzazione HLA o analisi dei cariotipo si sono dimostrati poco sensibili e non sempre utili a tale scopo. Per questa ragione si è cercato di individuare marcatori più specifici e tecniche più sensibili che potessero fornire informazioni sul chimerismo dei trapiantato. A tale scopo si è iniziato, già negli anni novanta, ad utilizzare regioni del genoma umano costituite da porzioni di DNA ripetuto in tandem (regioni minisatelliti e microsatelliti) che, per la loro natura, sono altamente variabili, e possono manifestare un pattern differente anche tra individui strettamente imparentati tra di loro. Grazie all’utilizzo della PCR (polymerase chain reaction), che amplifica porzioni specifiche del DNA in modo esponenziale anche partendo da una quantità dei bersaglio molto limitata, è stato possibile sia aumentare la sensibilità sia facilitare l’individuazione di un marcatore specifico e differente per il donatore ed il ricevente.

La sensibilità teorica di questa tecnica di monitoraggio si colloca al di sotto dello 1%, anche se risulta determinante il metodo di rilevazione del frammento di DNA amplificato.

In base alle caratteristiche sopra elencate e all’estrema praticità, si è iniziata la messa a punto dei metodo, allo scopo di monitorare il chimerismo nei pazienti dopo il trapianto allogenico. Una ricerca bibliografica sui più recenti studi condotti in questo ambito ci ha permesso la stesura di un protocollo metodologico e la raccolta dei marcatori molecolari che presentavano il più alto numero di polimorfismi nella popolazione caucasica. A questo è seguito una fase di messa a punto e di valutazione del metodo che hanno portato alla stesura di un protocollo standardizzato.

In questo ultimo anno sono stati monitorati 21 pazienti sottoposti a trapianto allogenico con un follow-up di circa 4130 gg. Quattro di questi hanno già superato l’anno dalla data di trapianto mantenendo il chimerismo completo. Non si è registrata, per ora, nessuna ricaduta né dal punto di vista molecolare né clinico. Solo in due pazienti non siamo riusciti ad individuare dei marcatori specifici per il donatore e il ricevente; in un caso si trattava di gemelli monozigotici (caratterizzati da un genotipo altamente omologo), in un altro di fratelli.

Da Aprile, con l’arrivo dei nuovo strumento ABI PRISM 310 Genetic Analyzer, ho iniziato a mettere a punto un protocollo di lavoro in previsione di un suo utilizzo nel monitoraggio dei chimerismo post-trapianto. In questo modo sarà possibile ottenere risultati in tempi più rapidi, con un dato sia qualitativo (presenza-assenza del frammento) sia semi-quantitativo (quantità di amplificato). L’utilizzo, poi, di una marcatura fluorescente dei DNA dovrebbe garantire una maggiore sensibilità dei metodo.

Metodi di evidenziazione di mutazioni

Con il progredire della ricerca nel campo della genetica e della oncoematologia, risulta sempre più evidente lo stretto legame che esiste tra la manifestazione neoplastica e la comparsa di mutazioni in alcuni geni nel genoma dei paziente. Se da una parte non è ancora possibile agire direttamente su di essi attraverso una terapia genica mirata, risulta comunque fondamentale, per la scelta di una terapia clinica più adeguata, la conoscenza specifica della mutazione responsabile di quel quadro ematologico. A tal fine vengono utilizzate una serie di tecniche molecolari in grado di evidenziare la presenza di sequenze differenti da quella normale che hanno, però, sensibilità, praticità e costi differenti.

Il procedimento più classico consiste nel sequenziamento diretto dei frammento di interesse attraverso il metodo di Sanger sia utilizzando un normale gel di sequenza che un sequenziatore automatico. Nel primo caso è necessario poter manipolare nel laboratorio materiale radioattivo, mentre nel secondo si deve utilizzare uno strumento molto costoso con spese di gestione, per singola reazione, ancora piuttosto elevate.

Per ovviare a questi problemi sono nate negli ultimi anni una serie di tecniche, quali SSCP (Single Stranded Conformational Polymorfism), DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), TGGE (Termal Gradient Gel Electrophoresis), Heteroduplex analysis, ed altri ancora, che sono in grado di evidenziare la presenza di una mutazione sconosciuta in un frammento di amplificato.

Si è ritenuto quindi utile, in previsione di una più massiva ricerca di mutazioni nei pazienti oncoematologici, l’acquisizione di una tecnica che unisse alla praticità ed economicità anche un elevato livello di sensibilità. A tale scopo ho effettuato un periodo di praticantato presso un laboratorio della Division of Molecular and Genetic Medicine dell’Università di Sheffield (UK). In quella sede ho utilizzato una tecnica di determinazione di recente sviluppo che bene si adattava alle nostre esigenze originarie. Il metodo, chiamato Conformation Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE), prende spunto dalla heteroduplex analysis con alcune variazioni nella preparativa del gel di corsa che ne aumentano notevolmente la sensibilità (>95%).

L’utilizzo combinato della tecnica CSGE con l’ABI PRISM 310 Genetic Analyzer ci permetterà, da prima, di evidenziare e selezionare i frammenti di DNA dei geni di interesse che presentano una sequenza diversa dal wild-type, e, successivamente, di individuare esattamente la mutazione attraverso il sequenzamento diretto degli stessi. In questo modo sarà possibile contenere i costi senza però perdere in capacità analitica. Anche in questo caso ho iniziato un lavoro di ottimizzazione per l’utilizzo dell’ABI PRISM 310 Genetic Analyzer come sequenziatore automatico.

Ringrazio vivamente l’AIL di Treviso per avermi dato l’opportunità di portare avanti il mio lavoro consentendomi di crescere anche dal punto di vista professionale. L’occasione mi è anche gradita per porgere i più sentiti saluti.

Vicenza, 25 Maggio 1998

Dott. Missiaglia Edoardo